小鼠海马神经元细胞原代分离培养

小鼠海马神经元细胞原代分离培养

背景知识：

细胞培养细胞培养技术也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。

技术原理：

细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须解决细胞离体培养问题，同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。

一、实验动物

   新生24h 内清洁级C57小鼠若干，客户提供。

二、主要仪器及试剂

1、主要实验仪器

2、主要试剂

3、主要试剂配制

（1）PBS磷酸盐缓冲液： PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min高压灭菌，44℃冰箱保存。

（2）接种液的配制：按胎牛血清与DMEM-F12培养液体积比1：10，无菌条件下加入1%体积分数的双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL，置于4℃冰箱保存。

（3）神经细胞维持培养液（无血清培养液）的制备 ：Neurobasal；2%B-27；1% 0.5mmol/L L-谷氨酰胺；1%青链霉素。换液前 3h 配制，置于4℃备用。

（4）0.01% L-多聚赖氨酸溶液的配制：称量 10mg L-多聚赖氨酸，溶于 100ml 灭菌去离子水，0.22μm 正压滤器过滤分装，-20℃保存。

（5）阿糖胞苷溶液的制备：   

a. Ara-C 储存液：称量 Ara-C 0.01g，溶于25mL去离子水中，即成 1.4mmol/L储备液。0.22μm 正压滤器过滤分装，置-20℃冰箱储存。

b. Ara-C 工作液： Ara-C储存液与无血清培养基以1:3 体积比配制成浓度为100µg/mL 的溶液。使用时按照培养液与100µg/mL的Ara-C体积比40:1 稀释，即Ara-C的工作浓度为2.5µg/mL。   

（6）0.4%台盼蓝溶液的配制：台盼蓝4 g，PBS少许（研磨），PBS定容至100mL，滤纸过滤，室温保存。

（7）4%多聚甲醛的配制：多聚甲醛4g，PBS 100mL加热至 60℃，边滴加1mol/L NaOH边搅拌，至液体澄清。

（8）四噻唑兰溶液配制：MTT50mg，PBS10mL磁力搅拌30min，0.22µm 微孔滤膜过滤分装，4℃保存，2周有效。

三、细胞操作实验方法

1、小鼠海马神经元细胞的原代分离培养

（1）培养板的包被

用0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养板和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。

吸弃 L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。

2、小鼠海马神经元细胞的分离及培养

（1）75%（体积分数）酒精消毒新生24h内的健康C57小鼠，在无菌条件下脱颈处死，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2，无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

（2）无菌分离海马组织。保持脑组织背面朝上，在镜下小心翻开大脑皮质，暴露海马，用眼科剪或尖镊分离海马周围组织，取出放入盛有D-Hank's液的平皿中。

（3）用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期间振摇 2~3 次。

（4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗2次。巴斯德吸管轻轻吹打 20次，制成细胞悬液，静置 2min。

（5）悬液收集于新的离心管，离心（1000rpm，10 min，4℃），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。

（6）将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度将细胞以400µL/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板或 100µL/孔接种 96 孔培养板。

（7）置 37℃、5%CO2培养箱培养 4-6h，全量更换为无血清培养液。

（8）体外培养第3d，加入Ara-C-工作液，以抑制非神经细胞过度增殖，作用 24 h后吸出。

（9）此后每 3d半量换液1次 , 体外培养第 7～21d的细胞用于实验。

四、无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。