小鼠小胶质细胞原代分离培养

小鼠小胶质细胞的原代分离培养

背景知识：

细胞培养细胞培养技术也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。

技术原理：

细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须解决细胞离体培养问题，同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。

培养板的包被

（1）将盖玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，浸洗、烘干。

（2）经 5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗20min，三蒸水冲洗，浸泡过夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精灯烤干，放入 24 孔细胞培养板。

（3）用 0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。

去除 L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。

小鼠小胶质细胞的混合培养

    (1) 75%（体积分数）酒精消毒新生 24h 内的清洁级小鼠，在无菌条件下断头，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2,无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

(2) 无菌剥离脑组织，除去小脑、海马、大脑髓质,分离大脑皮层，仔细剥离脑膜及血管。

(3) 用虹膜剪将组织剪切成 1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期间振摇 2～3 次。

（4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗两次。巴斯德吸管轻轻吹打至肉眼观察无明显的脑组织团块，静置 2min。

（5）悬液收集于新的离心管，离心（1000r/min，10 min，4℃），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。根据实验需要接种于若干个25cm细胞培养瓶或培养皿中。

（6）置 37℃、5%CO2培养箱培养24h后更换一次培养基，以后每3d换一次液，并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

小胶质细胞的分离和纯化

（1）细胞培养14～16d左右,在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的星型胶质细胞,小胶质细胞明显偏小呈类圆形、折光性强,附着于星型胶质细胞表面生长。

（2）倒掉培养液,用0.05%胰酶2～3mL消化,边观察边轻轻晃动培养瓶,等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来,将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10mL离心管，立刻用完全培养基终止消化。

（3）离心管配平,1000r/min, 离心5min, 弃上清；加定量完全培养再次吹打成细胞悬液,接种于预先包被的置有盖玻片的24孔培养板,置于CO2恒温细胞培养箱(37度)培养。

（4）生长24h后吸掉培养液,以去除未贴壁的少突胶质细胞,加完全培养液继续培养。

无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，操作时不能大声说话，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。